Авторы: С.П. Сергеева, А.А. Савин, А.В. Шишкина, Е.В. Виноградов
Введение
Ишемический инсульт (ИИ) занимает 2—3-е место в структуре общей смертности, представляя собой актуальную медико-социальную проблему [1]. Несмотря на постоянный поиск и совершенствование подходов к лечению и реабилитации пациентов, перенесших ИИ, смертность и ивалидизация в результате данного заболевания по-прежнему высока [2]. В связи с этим актуально дальнейшее со вершенствование стратегии оказания помощи больным ИИ. В свою очередь успех этой работы зависит от понимания механизмов развития ИИ и восстановления нарушенных функций, о которых можно судить, изучая гистологическую структуру пораженного мозга. Таким образом, исследование гистологических характеристик головного мозга после ИИ является важной задачей не только с точки зрения фундаментальной науки, но и практической неврологии.
В настоящей работе представлении данные исследования косвенных признаков воспаления, апоптоза и нейропластичности, играющих важную роль в развитии ИИ и восстановлении нарушенных вследствие него функций. Реактивное воспаление — один из механизмов повреждения нервной ткани при развитии церебральной ишемии. Процесс воспаления в ткани мозга реализуется при активации астроцитов и микроглии, аттракции лейкоцитов, увеличении концентрации провоспалительных цитокинов, включая IL-ip, TNF-a, моноцитарные хемокины MIP-la, МСР-1 и др. [3]. Клинические и экспериментальные исследования показали, что выраженность воспалительной реакции коррелирует с тяжестью повреждения мозга и долгосрочным прогнозом исхода ИИ [4, 5]. Апоптоз нейронов также является важным звеном патогенеза ИИ. Локальное ишемическое поражение головного мозга сопровождается изменением межклеточных взаимодействий, что в свою очередь сопровождается апоптозом нейронов, не только в перифокальной области, но также в других отделах ипси- и контралатерального полушария [6]. Отдельные исследования выявили, что основой изменений в интактной ткани мозга при его локальной ишемии являются механизмы нейропластичности [7]. Нейропластичность — способность нервной ткани изменять структурно-функциональную организацию под влиянием экзо- и эндогенных факторов [8].
Цель работы — анализ гистологических особенностей изменений ткани головного мозга после развития ИИ.
Материал и методы
Проведено проспективное исследование, которое не изменяло плана диагностических и лечебных мероприятий: все пациенты получали объем медицинской помощи в соответствии со стандартом медицинской помощи больным с ИИ при оказании специализированной помощи. Изучены полученные при аутопсии образцы ткани головного мозга 9 больных, умерших вследствие ИИ в бассейне левой средней мозговой артерии в течение 3 сут от момента поступления в стационар. Критерии исключения: нарушение мозгового кровообращения по геморрагическому типу, черепно-мозговая травма, онкологические и аутоиммунные заболевания в анамнезе, аллергические реакции во время пребывания в стационаре. Аутопсийный материал получали в патолого-анатомическом отделении ГКБ №36 им. Ф.И. Иноземцева Департамента здравоохранения Москвы. Исследование одобрено Межвузовским этическим комитетом.
В каждом случае образцы ткани брали из 3 зон головного мозга: 1) прилежащей непосредственно к очагу некротической ткани; 2) отдаленной от предыдущей на 5—10 см; 3) зоны контралатерального полушария, симметричной очагу ИИ. Образцы тканей головного мозга фиксировали в 10% забуференном формалине. После отмывания фиксатора в проточной воде проводили стандартную гистологическую проводку образцов путем обезвоживания в этиловом спирте. Затем кусочки ткани пропитывали парафином и заливали в парафиновые блоки. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) и растягивали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания).
Выявление белков р53, нейроспецифической енолазы (NSE), глиофибриллярного кислого белка (GFAP) проводили непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Для иммунофенотипирования использовали моноклональные антитела к указанным белкам человека («Vision biosystems novocastra», Великобритания), а также пероксидазную детекционную систему Peroxidase Detection System for Novocastra («Leica Microsystems», Германия), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стрептавидинпероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Иммуногистохимические реакции проводили согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. При завершении окрашивания выполняли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные гистологические и иммуногистохимические препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа Axio Scope А1 («Carl Zeiss», Германия) с использованием цифровой фотокамеры Canon PowerShot, программного обеспечения Axio Vision LE («Carl Zeiss», Германия). Контроль специфичности реакции проводили с помощью неиммунной сыворотки, а также антител к виментину («Dako», Дания). Часть срезов окрашивали по методу Ниссля и гематоксилином и эозином.
Вариационно-статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Значимыми считали различия при /КО,05. При проведении корреляционного анализа использовали коэффициент Пирсона для нормальных распределений и коэффициент ранговой корреляции Спирмена для ненормальных распределений.
Результаты и обсуждение
Из 948 пациентов, экстренно госпитализированных в неврологический стационар и отделение реанимации в период с 2011 по 2013 г., в результате тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) и инфаркта миокарда (ИМ) после перенесенного впервые ИИ в бассейне левой средней мозговой артерии в течение первых 7 сут пребывания в стационаре умерли 9 больных (5 женщин, средний возраст 79±6 лет, и 4 мужчин, средний возраст 67± 13 лет; 7 случаев ТЭЛА, 2 — ИМ). Их характеристики удовлетворяли критериям включения в исследование и тела подверглись аутопсии безотносительно данного исследования. По патогенетическому подтипу (в соответствии с критериями TOAST) в 4 случаях имел место кардиоэмболический ИИ, в 3 — ИИ неуточненной этиологии (сочетание нескольких возможных причин) и в 2 — атеротромботический ИИ. Состояние при поступлении в стационар у 7 пациентов было тяжелое, у 2 — средней тяжести. Значения по шкале оценки тяжести неврологического дефицита после инсульта Национального института здоровья (NIHSS) [9] на момент поступления составили 14±5 баллов. В клинической картине на первый план выступали правосторонняя гемиплегия и гемипарез, центральный парез лицевого нерва, нарушения речи преимущественно по типу сенсомоторной афазии, расстройства чувствительности. ИИ развился на фоне артериальной гипертензии (АГ), атеросклероза, сахарного диабета, мерцательной аритмии.
При гистологическом исследовании головного мозга с использованием стандартных методик окрашивания гематоксилином и эозином и крезиловым фиолетовым по Нисслю обнаружили снижение общего количества нейронов и глиальных элементов, преимущественно в образцах из перифокального участка (1-я зона). Отмечали диффузное запустение участков коры мозга как в ипсилатеральном, так и контралатеральном полушариях. При этом выраженность изменений в ипсилатеральном полушарии была большей и наиболее выраженной в 1-й зоне, непосредственно прилегающей к очагу некроза. В очаге некроза и прилежащей к нему 1-й зоне наблюдалась лейкоцитарная инфильтрация. Во всех зонах исследования наблюдали признаки изменения регионарного кровотока в виде венозной гиперемии, стаза, агрегации эритроцитов, периваскулярного отека.
У всех пациентов выявили изменения сосудистой стенки артерий, характерные для АГ и атеросклероза. При преобладании в клинической картине АГ наблюдали явления миоэластофиброза, склероза, гиалиноза, нарушения структурной целостности внутренней эластической мембраны, атрофию гладких мышечных волокон, что сопровождалось деформацией формы и уменьшением просвета артерий. При преобладании в клинической картине атеросклероза отмечали фиброз с формированием фиброзных бляшек, гиалиноз, истончение мышечной оболочки артерий, явления вторичного липоидоза.
При сочетании АГ и атеросклероза выявили гиалиноз, сюгероз, уменьшение количества мышечных и эластических волокон.
Апоптоз и нейропластичность
Во всех зонах исследования обнаружены изменения нейронов в виде гомогенизации и инкрустации цитоплазмы, деформации и сморщивания ядер, кариоцитолиза с образованием клеток-теней, хроматолиза, перемещения ядра на периферию клетки и его набухания, смещения ядрышка к периферии ядра, перицеллюлярного отека. Выраженность указанных изменений достигала максимума в 1-й зоне, где все нейроны подверглись повреждению. В 3-й зоне встречались лишь отдельные участки нервной ткани, где наблюдались вышеописанные изменения. В обоих полушариях были выявлены также признаки саттелитоза и нейронофагии. То, что данные изменения происходят именно в нейронах, было доказано при использовании непрямого иммунопероксидазного иммуногистохимического метода для выявления NSE.
Возможности метода не предполагают количественного определения фермента, однако отдельные нейроны демонстрировали значительно более яркую реакцию NSE (рис. 1). На этом основании можно сделать заключение о более интенсивной экспрессии NSE в нервных клетках. NSE —гликолитический фермент семейства енолаз, участвующий в предпоследнем этапе гликолиза, катализирует отщепление воды от 2-фосфоглицериновой кислоты. В результате образуется фосфоенолпируват — соединение, содержащее макроэргическую фосфатную связь. Усиление метаболической активности нейронов сопровождается увеличением содержания этого фермента в цитоплазме. Поэтому иммуногистохимическую реакцию NSE (2-фосфо- D-глицерат гидролаза) считают индикатором нейрональной активности [10].
Указанный феномен более интенсивной реакции NSE имел место во 2-й и 3-й зонах исследования, т.е. отмечался как на стороне поражения, так и в контралатеральном полушарии. При этом в 1-й зоне интенсивность реакции NSE уменьшалась в зависимости от близости нейронов к очагу некроза. Полученные данные соответствуют результатам работ исследовательской группы, которая использовала иммунофлюоресцентное окрашивание NSE и при помощи специального программного обеспечения измеряла площадь флюоресцирующих гранул маркера в поле зрения [11]. Авторы сделали заключение, что при острой очаговой ишемии головного мозга в неповрежденных нейронах компенсаторно увеличивается содержание NSE, что свидетельствует об их высокой функциональной активности.
Данная высокая функциональная активность является субстратом для реализации пластических реакций в сохранившихся нейронах, а также пере- 1 стройки аналогичных по функциям нейронов, ранее не задействованных и расположенных на отдалении от зоны повреждения, что в результате должно приводить к выраженной структурно-функциональной реорганизации работы мозга. При этом известно, что процессы пластичности вовлекают корковый и субкортикальный уровни, включая таламус, базальные ганглии и структуры ствола мозга [12], где должны происходить сходные изменения вне зависимости от локализации очага и характера поражения головного мозга.
Об активации процессов апоптоза нейронов судили по выраженности экспрессии белка р53, который выявляли при помощи непрямого иммунопероксидазного иммуногистохимического метода. Доказательством того, что указанные изменения происходят именно в нейронах, считали реакцию тех же клеток с NSE в дублирующих срезах. Белок р53 является специфическим транскрипционным фактором. Гены, транскрипцию которых стимулирует белок р53, кодируют белки-компоненты апоптотической программы и белки, регулирующие клеточный цикл. Активация белка р53 происходит в ответ на многочисленные стрессовые стимулы, к которым относится гипоксия [13]. Ишемия-реперфузия коры теменной доли крысы увеличивает в нейроцитах концентрацию белка р53 в раннем ишемически-реперфузионном периоде [14].
В настоящем исследовании наибольшее количество р53-позитивных нейронов отмечено в 1-й зоне. Во 2-й и 3-й зонах маркированные р53 клетки присутствовали в меньших количествах, однако участки их расположения находились в непосредственной близости с участками расположения нейронов с усиленной реакцией на NSE (рис. 2, 3). На этом основании можно предположить, что экспрессия р53 в отдельных нейронах 2-й и 3-й зон свидетельствует о том, что эти нейроны после структурно-функциональной перестройки нервной ткани оказались не задействованными во вновь образованных связях и подверглись апоптозу.
При реакции GFAP на дублирующих срезах выявили, что нейроны с усиленной реакцией на NSE, а также р53-позитивные нейроны во 2-й и 3-й зонах находятся на приближенном расстоянии к астроци- там по сравнению с другими нейронами этих зон, в которых указанные феномены отсутствовали (рис. 4). Известно, что компенсаторная активация метаболизма части сохранившихся нейронов сопровождается активацией пула астроцитов [15]. Опубликованы данные о том, что процессы обучения и реализации механизмов запоминания сопровождаются повышением числа астроцитов в определенных участках мозга [16]. Астроциты для
снабжения нейронов энергией используют продукт расщепления гликогена — лактат, который проходит через мембрану нейронов с участием специализированных транспортных белков [17]. С учетом вышесказанного можно предположить, что астроциты принимают участие в энергетическом обеспечении нейропластичности и апоптоза после церебральной ишемии.
Воспаление
При реакции GFAP выявили деформацию, гипертрофию интра- и перицеллюлярный отек, набухание астроцитов в 1-й зоне. При этом в данной зоне наблюдали увеличение их количества, причем наиболее выраженное скопление астроцитов выявлялось периваскулярно (рис. 1). В зонах деструкции мозговой ткани погибшие астроциты были представлены GFAP-позитивными зернистыми массами. Во 2-й зоне также наблюдались незначительные явления интра- и перицеллюлярного отека (рис. 2).
Выявили факт наибольшей выраженности лейкоцитарной инфильтрации именно в перифокальной области (1-я зона), где также обнаружили увеличение количества астроцитов. Известно, что астроциты играют ключевую роль в развитии и ограничении воспалительного процесса в ЦНС [18]. Активированные астроциты и микроглия — основные источники цитокинов в ЦНС [19]. В указанной 1-й зоне отмечается также максимальное количество р53 позитивных клеток, что может быть следствием взаимодействия мембранных рецепторов смерти нейронов и глии с соответствующими лигандами на мембране лейкоцитов, что инициирует апоптоз нейронов [6].
ИИ сопровождается выраженными гистологическими изменениями: уменьшением общего количества нейронов и глиоцитов, их пространственным перераспределением, изменением структуры клеток и их функциональной активности. Данные изменения с разной степенью выраженности происходят как в прилежащих к очагу некроза, так и в удаленных от него участках.
Высокая функциональная активность отдельных расположенных на отдалении от зоны повреждения нейронов является субстратом для реализации пластических реакций, что делает особенно актуальным поиск новых стратегий нейропротекторной терапии. Нейроны, не встроившиеся в новую функциональную сеть, элиминируются посредством апоптоза. Астроциты принимают участие в энергетическом обеспечении и регуляции нейропластичности и апоптоза после ИИ.
Литература
1. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская JI.B. Проблема инсульта в Российской Федерации: время активных действий. Журнал неврологии и психиатрии имени С. С. Корсакова. 2007;107(8):4-10.
2. MozaffarianD, BenjaminЕ J, GoAS, ArnettDK, BlahaMJ, CushmanM, HowardVJ. Heart Disease and Stroke Statistics—2016 Update A Report From the American Heart Association. Circulation. 2015;132:1-323.
doi: 10.1161/CIR.0000000000000350
3. Offner H, Subramanian S, Parker SM, Afentoulis ME, Vandenbark AA, Hum PD. Experimental stroke induces massive, rapid activation of the peripheral immune system. J Cereb Blood Now Metab. 2006;26:654-665.
doi: 10.1038/sj.jcbfm.9600217
4. Worthmann H, Tryc , Goldbecker A, Ma YT, Tountopoulou A, Hahn A, Dengler R, Lichtinghagen R, Weissenborn K. The temporal profile of inflammatory markers and mediators in blood after acute ischemic stroke differs depending on stroke outcome. Cerebrovasc Dis. 2010;30:85-92.
doi: 10.1159/000314624
5. Liu Y, Zhang J, Han R, Liu H, Sun D, Liu X. Downregulation of serum brain specific microRNA is associated with inflammation and infarct volume in acute ischemic stroke. Journal of Clinical Neuroscience. 2015;22(2):291-295.
doi: 10.1016/j.jocn.2014.05.042
6. Broughton BRS, Reutens DC, Sobey CG. Apoptotic Mechanisms After Cerebral Ischemia. Stroke. 2009;40:331-339.
doi: IO.H6I/STROKEAHA.IO8.531632
7. Johansson BB. Neurorehabilitation and brain plasticity. J Rehabil Med. 2003;35:1-12.
doi: 10.1080/16501970306105
8. Гусев Е.И., Камчатнов П.P. Пластичность нервной системы. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2004;3:73-79.
9. Brott Т, Adams HP, Olinger CP, Marler JR, Barsan WG, Biller J, Hertzberg V. Measurements of acute cerebral infarction: a clinical examination scale. Stroke. 1989;198920(7):864-870.
doi: 10.1161/01.STR.20.7.864
10. Yardimoglu M, Ilbay G, Dalcik C. Immunocytochemistry of neuron specific enolase (NSE) in the rat brain after single and repeated epileptic seizures. Int JNeurosci. 2008;118(7):981-983.
doi: 10.1080/00207450701769232
11. МыцикA.B., АкулининВ.А., СтепановC.C., ЛарионовП.М. Влияниеишемиинанейроглиальныевзаимоотношениялобнойкорыбольшогомозгачеловека. Омскийнаучныйвестник. 2013; 118(1):74-77.
12. Ward NS, Cohen LG. Mechanisms underlying recovery of motor function after stroke. Archives of neurology. 2004;6l (12): 1844-1848.
doi: 10.1001/archneur.61.12.1844
13. Zhai D, Chin K, Wang M, Liu F. Disruption of the nuclear p53-GAPDH complex protects against ischemia-induced neuronal damage. Molecular brain. 2014;7(1):1.
doi: 10.1186/1756-6606-7-20
14. Кметь Т.И. Влияние острого нарушения кровообращения в бассейне сонных артерий на содержание белка р53+ в нервных и глиальных клетках коры теменной доли больших полушарий головного мозга лабораторных крыс. Вестник Казахского Национального медицинского университета. 2015;2:485-487.
15. Verkhratsky A, Nedergaard М, Hertz L. Why are astrocytes important? Neurochemical research. 2015;40(2):389-401.
doi: 10.1007/s 11064-014-1403-2
16. Haydon PG, Nedergaard M. How do astrocytes participate in neural plasticity? Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2015;7(3):020438.
doi: 10.1101/cshperspect.a020438
17. Suzuki A, Stern SA, Bozdagi O, Huntley GW, Walker RH, Magistretti PJ, Alberini CM. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation. Cell. 2011; 144(5):810823.
doi: 10.1016/j.cell.2011.02.018
18. Sofroniew MV. Astrocyte barriers to neurotoxic inflammation. Nature reviews Neuroscience. 2015;16(5):249-263.
doi: 10.1038/nrn3898
19. Kaur G, Han SJ, Yang I, Crane C. Microglia and central nervous system immunity. Neurosurg Clin NAm. 2010;21:43-51.
doi: 10.1016/j.nec.2009.08.009
Источник: журнал неврологии и психиатрии, 3, 2017; Вып. 2