Электронный журнал "Архитектура здоровья"
Категория: Клинические исследования

Автор: Каримова Э.Р.

 

Ведущее место в патогенезе развития сердечно-сосудистых заболеваний принадлежит дисфункции эндотелия. Прямым клеточным маркером повреждения и ремоделирования эндотелия могут выступать циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК) периферической крови. Целью настоящего исследования явилась разработка нового подхода к диагностике дисфункции эндотелия путем определения количества ЦЭК методом проточной цитометрии и использование определения ЦЭК в оценке риска развития ишемической болезни сердца (ИБС) у женщин молодого и среднего возраста.

 

Оценка функции эндотелия 

Одним из основных патофизиологических механизмов развития ишемической болезни сердца (ИБС) является нарушение функциональной активности сосудистого эндотелия и его структурной целостности. Для оценки функции эндотелия в клинической практике используются инструментальные методы исследования (прямая плетизмография, ультразвуковая диагностика) эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилятации с помощью фармакологических проб (например, с ацетилхолином, нитроглицерином), пробы с реактивной гиперемией, холодовым стрессом. При всех достоинствах этих методик имеются определенные ограничения для их применения в повседневной клинической практике - необходимость наличия дорогостоящей ультразвуковой аппаратуры, высококвалифицированных специалистов, трудоемкость, что делает возможным использование их лишь в крупных научных центрах. В лабораторной практике в настоящее время для оценки выраженности дисфункции эндотелия определяют в крови уровень антигена фактора Виллебранда как косвенного маркера повреждения эндотелия. Также возможно определение ряда биологически активных веществ, образующихся в эндотелии, таких как оксид азота (N0), эндотелии-1, ангиотензин-П, тромбоксан А2, фактор роста и пролиферации сосудов и др., однако, поскольку большая часть этих веществ синтезируется и в других клетках, их диагностическая ценность не однозначна.

 

 

Циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК) – это зрелые дифференцированные клетки, которые отделяются от стенки эндотелия в процессе его повреждения и потому могут выступать прямым клеточным маркером дисфункции эндотелия. Количество ЦЭК в периферической крови у здоровых людей очень мало, так как при отсутствии патологических состояний процесс обновления эндотелия медленный, а нежизнеспособные ЦЭК быстро удаляются из кровотока ретикулоэндотелиальной системой. В то же время рядом авторов показано увеличение количества этих клеток при различных патологических состояниях, включающих инфекционные заболевания, иммунно-опосредованные васкулиты, злокачественные новообразования и широкий спектр сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, у больных с острым инфарктом миокарда (ИМ) высокий уровень ЦЭК в периферической крови в первые сутки являлся независимым предиктором смерти и сердечно-сосудистых осложнений в отдаленном периоде, что может быть использовано в стратификации сердечно-сосудистого риска.

 

 

Эндотелиальные клетки толщиной около 1-2 мкм диаметром 10-20 мкм имеют плоскую форму, вытянутое, расположенное в центре, ядро и как выяснилось, характеризуются выраженной морфологической неоднородностью. Эндотелиальные клетки могут отсоединяться от стенки сосуда как в виде жизнеспособных клеток, так и в виде клеточных фрагментов, ЦЭК могут быть также представлены в периферической крови апоптотическими клетками, которые можно отличить путем окрашивания пропидиемйодида, так как при апоптозе нарушена целостность плазматической мембраны.

Целью настоящего исследования явилась разработка нового подхода к оценке дисфункции эндотелия путем определения количества ЦЭК методом проточной цитометрии с использованием моноклональных флюоресцентно меченых антител к CD 146 и CD45, определить уровень ЦЭК в периферической крови у женщин с ИБС молодого и среднего возраста и в контрольной группе и применить методику количественного определения ЦЭК при оценке риска развития ИБС и ее осложнении у женщин молодого и среднего возраста.

 

Материалы и методы

Определение количества ЦЭК в периферической крови осуществляли на проточном цитофлуориметре CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием меченных флуорохромами моноклональных антител к поверхностным маркерам клеток: CD 146-РЕ (phycoerythrin - фикоэритрин; Becihan Coulter, США) в качестве метки для ЦЭК и CD45-PC5 (phycoerythrin + cyanine 5 - фикоэритрин + цианин 5; Beckman Coulter, США) как панлейкоцитарный маркер. Для исследования использовали цельную венозную кровь, взятую натощак в утренние часы из локтевой вены в стерильные вакуумные пробирки, содержащие 100 мкл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0) в качестве антикоагулянта.

В исследование было включено 111 женщин, из которых сформировали две группы: 1-я группа (основная) - 62 пациентки с ангиографически подтвержденной ИБС, стенокардией напряжения на уровне I—II функционального класа (от 35 до 59 лет, средний возраст 5 I ± 6 лет) и 2-я группа (контрольная)-49 женщин без анамнеза ИБС и с отрицательным результатом нагрузочного тредмил-теста (от 35 до 74 лет, средний возраст 52 ± 9 лет).

В основной группе у 51 (82%) женщины в анамнезе был острый инфаркт миокарда - ИМ (давностью более двух лет к моменту включения в исследование). Хирургическая реваскуляризация миокарда была выполнена у 58 (93%) больных 1 -й группы (чрескожная ангиопластика и стентирование коронарных артерий у 33 (64%) женщин с ИБС и с ИМ в анамнезе и у 6 (54%) - с ИБС и без ИМ; аортокоронарное шунтирование -у 13 (25%) пациенток с ИБС и с ИМ в анамнезе и у 5 (46%) с ИБС и без ИМ) также давностью более двух лет к моменту включения в исследование. Все больные получали антиагрегантную терапию препаратами ацетилсалициловой кислоты; кроме того 52 (86%) пациентки получали статины, 45 (73%) - ингибиторы АПФ, 48 (77%) - В-блокаторы.

 

Результаты исследований

Количество ЦЭК из расчета на 3 • 1О5 лейкоцитов оказалось повышено в группе женщин с ИБС по сравнению с группой контроля: 7,4 ± 1,3 и 3,9 ± 0,4 соответственно (р = 0,003) (диаграмма 1). В основной группе уровень ЦЭК был выше у женщин с ИМ в анамнезе в сравнении с группой без ИМ: 8,2 ± 1,5 и 3,6 ± 0,8 соответственно (р = 0,02). Сохранялись статистически значимые различия по уровню ЦЭК у женщин с ИБС и ИМ в анамнезе в сравнении с группой контроля: 8,2 ± 1,5 и 3,9 ± 0,4 соответственно (р = 0,0005). При сравнении количества ЦЭК в периферической крови у женщин с ИБС без ИМ в анамнезе и в контрольной группе достоверных различий найдено не было, что, однако, может быть обусловлено малой выборкой больных ИБС без ИМ (и = II) (диаграмма 2).

 

Диаграмма 1. Количество ЦЭК на 3-105 лейкоцитов у женщин с ИБС и в контрольной группе.

 

Диаграмма 2. Количество ЦЭК на 3-105 лейкоцитов у женщин с различными формами ИБС и в контрольной группе.

 

По результатам исследования, наличие более трех ЦЭК на 3 • 105 лейкоцитов в периферической крови сопровождалось увеличением относительного риска развития ИБС у женщин молодого и среднего возраста в 4 раза (CIOR = [0,74 -2,5]) и риска развития острого ИМ в 8 раз у женщин с ИБС (CIOR = [0,62-4,3]).

 

Опыт зарубежных исследователей

В зарубежных исследованиях для определения количества зрелых дифференцированных эндотелиальных клеток наиболее широко используется методика CD 146-опосредованной иммуномагнитной изоляции, основанная на инкубации клеток крови с магнитными шариками, которые связаны с моноклональными антителами, распознающими поверхностный антиген, экспрессируемый эндотелиальными клетками (анти-CD 146). Подсчет клеток после их отделения концентратором магнитных частиц проводится с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии. Изолированные зрелые эндотелиальные клетки должны быть ядерными клетками большого диаметра, которые связывают более пяти магнитных шариков и окрашиваются лектином Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), который селективно распознает эндотелиальные клетки путем связывания с фукозой на поверхности этих клеток. Ограничения этой методики связаны главным образом с невозможностью полного отделения ЦЭК от остальных циркулирующих в крови клеток, длительностью процедуры исследования и отсутствием автоматизации.

 

 

Сравнительно недавно методика иммуномагнитной изоляции ЦЭК в периферической крови стала активно вытесняться методом проточной цитометрии, основанным на регистрации сигналов светорассеяния и флюоресценции лазерного луча от каждой отдельно взятой клетки. Сигнал прямого светорассеяния дает представление о размере клетки, а бокового светорассеяния - о соотношении ядро цитоплазма, наличии гранул и других внутриклеточных включений, что позволяет в целом судить о морфологии клетки и выделять различные популяции клеток для дальнейшего анализа. Поскольку нежизнеспособные клетки, фрагменты разрушенных клеток (дебрис) и тромбоциты дают слабое светорассеяние, их можно исключить из анализа с помощью дискриминатора прибора. Сигнал флюоресценции, исходящий от флюоресцентных меток моноклональных антител к поверхностным антигенам клеток (CD-маркерам), регистрируется системой светофильтров и фотоумножителей в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому, что позволяет дифференцировать клетки в зависимости от их CD-принадлежности. В нашем исследовании для идентификации ЦЭК мы использовали маркер CD 146-РЕ (фикоэритрин) и в качестве панлейкоцитарного маркера CD45-PC5 (фикоэритрин + цианин 5), который в том числе связывает и активированные Т-лимфоциты. Некоторыми зарубежными исследователями с целью повышения чувствительности методики дополнительно используется маркер CD31 для исключения из анализа безъядерных клеток, таких как тромбоциты, и фрагментов разрушенных эндотелиальных клеток.

Метод проточной цитометрии для определения количества ЦЭК впервые был применен зарубежными исследователями у больных с неопластическими заболеваниями, однако до сих пор не существует единого протокола исследования. Показана хорошая сопоставимость (более 95%) методов иммуномагнитной изоляции и проточной цитометрии для количественной оценки ЦЭК в периферической крови. Несмотря на то что иммуномагнитная изоляция считается золотым стандартом для определения уровня ЦЭК, метод проточной цитометрии является автоматизированным, имеет низкую вариабельность результатов, не требует больших затрат времени на исследование и подходит для рутинной клинической лабораторной практики.

Предполагают, что увеличение в крови содержания зрелых эндотелиальных клеток может наблюдаться во время нормального роста организма или регенерации ткани и быть либо физиологическим (например, после менструации), либо патологическим в ответ на повреждения стенки сосуда различными повреждающими факторами. Результаты достаточно большого количества исследований показали, что уровень ЦЭК в периферической крови повышается при заболеваниях, связанных с поражением сосудов: сердечно-сосудистых, иммуноопосредованных васкулитах, злокачественных новообразованиях, серповидно-клеточной анемии и др. Основываясь на этом факте, можно предполагать, что уровень ЦЭК в периферической крови является отражением системного повреждения эндотелия.

В ряде научных работ показано, что уровень ЦЭК у больных с острым коронарным синдромом (ОКС) был значимо выше, чем у пациентов со стабильной стенокардией и в контрольной группе, и достоверно не отличался от такового у больных со стабильной стенокардией и здоровых людей. Также не было найдено различий в количестве ЦЭК между пациентами с нестабильной стенокардией, острым ИМ с подъемом сегмента ST и острым ИМ без подъема сегмента ST. Тем не менее в этих же исследованиях отметили снижение количества ЦЭК уже через 48 ч от начала развития ОКС; это позволяет предполагать, что высокий уровень ЦЭК у больных с ОКС скорее всего выступает маркером острого повреждения сосудистой стенки, нежели отражает дисфункцию эндотелия. Это подтверждают результаты исследований, в которых продемонстрирована прямая связь между уровнем ЦЭК в периферической крови и уровнем антигена фактора Виллебранда в плазме у больных острым ИМ. Более того, было установлено, что высокий уровень ЦЭК в первые 48 ч у больных с ОКС выступает прогностически неблагоприятным фактором риска развития сердечно-сосудистых осложнений в раннем и отдаленном периодах заболевания. Таким образом, поскольку в исследовании все больные на момент включения в исследование имели стабильное течение ИБС, высокий уровень ЦЭК у женщин с ИМ в анамнезе скорее всего обусловлен исходно более выраженной дисфункцией эндотелия, которая может не только лежать в основе развития атеросклероза коронарных артерий и, следовательно, ИБС, но и быть причиной неблагоприятных сердечно-сосудистых событий.

 

 

Источник: по материалам журнала «Клиническая лабораторная диагностика» №4, 2015

Чтобы оставить комментарий, Вам необходимо авторизоваться (либо зарегистрироваться)

Комментарии

  • Комментариев пока нет