Авторы: А.Б. Шехтер, А.Е. Гуллер, Л.П. Истранов, Е.В. Истранова, А.В. Бутнару, А.З. Винаров,

О.Л. Захаркина, А.В. Курков, А.Ф. Кантимеров, Е.Н. Антонов, А.В. Марисов, Е.В. Глыбочко

 

Актуальность темы

Тканеинженерные конструкции (ТИК), которые используются в качестве пластического материала для реконструктивной хирургии, состоят из подложек-носителей, называемых матриксами, матрицами или скаффолдами, и культивируемых на них клеток различных типов [1].

Помимо адекватных механических свойств, делающих матриксы пригодными для хирургического применения, они должны обеспечивать прикрепление и рост клеток, быть биосовместимыми (не иметь токсических, иммуногенных и аллергогенных свойств), обладать биорегулируемой резорбцией, не вызывать воспалительной и дистрофической тканевой реакции, замещаясь в конечном итоге собственными тканями организма. Кроме того, желательно, чтобы скаффолды обладали пористой структурой, обеспечивающей быстрое прорастание в него клеток и сосудов реципиента для питания и приживления ТИК.

Этим требованиям в значительной степени соответствуют коллагеновые материалы, которые по способу получения делятся на 2 типа: 1) децеллюляризированные коллагенсодержащие ткани и 2) биоматериалы, полученные из растворов коллагена. Децеллюляризация (ДЦЛ) – процедура ферментной или физической обработки тканей, обеспечивающая разрушение клеточных элементов при сохранении внеклеточного матрикса [4, 5]. Другой подход основан на двух последовательных процессах: растворении коллагена, полученного из различных тканей, и последующей реконструкции коллагеновых фибрилл из раствора. Биоматериалы (губки, пленки, гидрогели) используются в виде скаффолдов для ТИК или пластического материала для хирургии [5]. Для решения проблемы недостаточной прочности матриксов могут быть использованы гибридные скаффолды, представляющие собой композиты коллагена и синтетических полимеров [6].

Цель работы – выбор оптимальных материалов для тканевой инженерии в урологии и других областях медицины на основании изучения динамики морфологических изменений 9 типов коллагеновых и гибридных скаффолдов при подкожной имплантации в эксперименте на крысах с использованием методов гистологии, гистохимии и нелинейной оптической микроскопии (НЛОМ). 6 скаффолдов разработаны впервые и приготовлены по оригинальной технологии. 

 

Материал и методы

Для исследования приготовлены 9 видов коллагенсодержащих скаффолдов (табл. 1): три вида получены на основе реконструированного коллагена, ДЦЛ обработанные ткани животных и человека.

 

 

Имплантационный тест выполнен на 225 белых крысах линии Wistar. Животных наркотизировали растворами золетила (6 мг/кг, Zoletil 100, Италия) и рометара (0,5 мл/кг, Rometar, «Spofa», Прага). Под кожу в межлопаточной области были имплантированы образцы исследуемых скаффолдов размером 1 х 1 см. Животные были разделены на 9 групп по 25 крыс в группе и выводились из опыта путем передозировки золетила на 5, 10, 30, 60 и 90-е сутки — по 5 животных на срок. Область имплантации иссекали, полученные ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (г-э), пикрофуксином по ван Гизону (В-Г) на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна и изучали с помощью микроскопа Olympus ВХ51, оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия). Микрофотографирование препаратов проводили с помощью программы Launch Cam-View.

Неокрашенные препараты для НЛОМ толщиной 22 мкм изучались на базе приборного комплекса, включающего в себя инвертированный микроскоп Leica DMIRBE, систему сканирующей конфокальной микроскопии Leica TCS SP2, лазеры для возбуждения одно- и двухфотонной флюоресценции (ДФФ) и генерации второй гармоники (ГВГ). ГВГ-микроскопия позволяет избирательно визуализировать структуры, состоящие из фибриллярного коллагена, а ДФФ-микроскопия — получать изображения ткани, характеризующие ее общий план строения. Также использовали наложения ДФФ- и ГВГ- сигналов. Размер получаемых изображений соответствовал 375x375 мкм, а разрешение — 1024х 1024 пикселя.

Содержание и использование лабораторных животных соответствовало рекомендациям локального комитета по этике при Первом МГМУ им. И.М. Сеченова.

 

Результаты исследования

В 1-й и 2-й группах (имплантация коллагеновых губок) тканевая реакция на имплантацию и динамика биодеградации скаффолдов были сходными. На 5-е сутки поры (ячейки) губок частично заполнялись фибрином, нейтрофилами и макрофагами, коллаген подвергался макрофагальной резорбции и лизису коллагеназами (рис. 1, а, б).

 

Рис. 1. а,б

 

Вокруг губок отмечался отек ткани, слабая воспалительная реакция, пролиферация фибробластов, которые вместе с новообразованными сосудами прорастали в периферические области губок (см. рис. 1, в).

 

Рис. 1. в, г.

 

На 10-е сутки коллагеновые имплантаты практически полностью исчезали и замещались созревающей соединительной тканью (см. рис. 1, г), которая к 30-м суткам фиброзировалась и резко уменьшалась в объеме, а к 60-м суткам подвергалась инволюции.

В 3-й группе (имплантация коллаген-викрилового композита) к 10-м суткам коллаген резорбировался, замещаясь грануляционной тканью, клетки и сосуды которой прорастали между порами викриловой сетки (рис. 2, а).

 

Рис. 2. а, б

 

Через 30 сутки викриловые нити сближались между собой вследствие фиброзирования соединительной ткани, а составляющие их филаменты частично подвергались резорбции макрофагами и многочисленными гигантскими клетками инородных тел (см. рис. 2, б). Через 60 сутки грануляционная ткань еще больше фиброзировалась, нити викрила частично резорбировались (см. рис. 2, в), а к 90-м суткам они уже отсутствовали (см. рис. 2, г).

 

Рис. 2. в, г.

 

В 4-й группе опытов (ДЦЛ и лиофилизированная дерма коров) через 7 суток матрикс оставался пористым. Толстые стенки пор состояли из бесклеточного коллагена (рис. 3, а).

 

Рис. 3. а.

 

Вокруг имплантатов формировалась капсула из грануляционной ткани (см. рис. 3, б), а в периферический слой имплантатов прорастали тяжи фибробластов и макрофагов.

 

Рис. 3. б, в.

 

Заметная резорбция коллагена имплантатов макрофагами и гигантскими многоядерными клетками происходила только на 30-е сутки (см. рис. 3, в).

Через 60 сутки в подкожной жировой ткани оставались лишь небольшие фрагменты коллагеновой губки, а через 90 суток следы имплантатов не обнаруживались, ткань подвергалась инволюции.

По данным НЛОМ, на 7-е сутки материал характеризовался сильным и контрастным ГВГ-сигналом (см. рис. 3, г, д, е).

 

Рис. 3. г, д, е

 

При этом на ГВГ-изображении визуализировались фибриллярные структуры коллагена. Показательно, что при изучении таких образцов с помощью сканирующей и особенно трансмиссионной электронной микроскопии также выявляется фибриллярность коллагена, которая не видна на световой микроскопии [7]. К 30 – 60-м суткам интенсивность и контрастность ГВГ-сигнала оставшегося коллагена имплантата снижались, что свидетельствует об изменениях на молекулярном и фибриллярном уровнях во время резорбции. Остатки имплантатов окружались соединительнотканной капсулой, которая к 60-м суткам существенно уплотнялась и фиброзировалась, что выражалось в усилении ГВГ-сигнала собственного коллагена.

У животных 5-й группы, которым имплантировали аналогичный материал из дермы лошадей, через 7 суток материал также сохранял пористую структуру, но был более плотным. Поры (ячейки) имели меньший размер (рис. 4, а).

 

Рис. 4. а, б

 

Резорбция коллагена происходила быстрее (см. рис. 4, б) . Через 60 и 90 сутки имплантаты уже не выявлялись. В отличие от 4-й группы НЛОМ не выявила в коллагене имплантата контрастного сигнала ГВГ при наличии сигнала ДФФ (см. рис. 4, в, г, д), что, по нашим предыдущим исследованиям [7], свидетельствует о нарушении фибриллярной структуры.

 

Рис. 4. в, г, д.

 

В 6-й группе (имплантация аналогичного материала дермы рыб) матрикс состоял из коллагеновых волокон, имеющих зигзагообразную форму и ориентированных параллельно. Пористая структура не выявлялась (рис. 5, а). Важная особенность – формирование вокруг имплантатов более толстой капсулы, фиброзирующейся уже к 7-м суткам (см. рис. 5, б).

 

Рис. 5. а, б, в, г

 

В капсуле и окружающих тканях отмечалась лимфомакрофагальная инфильтрация, что, возможно, связано с большей иммуногенностью децеллюляризированной дермы рыб. Через 30 суток обнаруживалась интенсивная резорбция имплантатов макрофагами и гигантскими клетками, а к 60-м и 90-м суткам они уже не обнаруживались. При НЛОМ- исследовании на 7-е сутки в имплантатах были видны коллагеновые волокна и пучки с отчетливым сигналом ГВГ (см. рис. 5, в, г). В период от 30 до 60 суток наблюдалась фрагментация и лизис материала с постепенным снижением интенсивности и контрастности сигнала ГВГ.

В 7-й группе на 7-е сутки после имплантации децеллюляризированной твердой мозговой оболочки в ней полностью сохранялась структура коллагеновых волокон. Вокруг скаффолдов формировалась капсула из грануляционной ткани. Через 30 и 60 суток имплантаты почти не изменялись, сохраняя плотную коллагеновую структуру, вокруг которой выявлялась зрелая соединительнотканная капсула (рис. 6, а). Через 90 суток имплантаты местами фрагментировались, но почти не прорастали соединительной тканью. При НЛОМ-исследовании на 7-е сутки (см. рис. 6, б) и в дальнейшем до 90 суток материал давал сильный ГВГ-сигнал.

Рис. 6. а, б, в, г.

 

В 8-й группе на месте скаффолдов SIS на 7-е сутки обнаруживалась фиброзирующаяся грануляционная ткань, в которой были видны многочисленные лентовидные фуксинофильные по ван Гизону фрагменты имплантированного материала (см. рис. 6, в). Гигантоклеточная реакция при резорбции коллагена SIS была относительно слабой, резорбция коллагена происходила за счет активности макрофагов и ферментативного лизиса. На 30-е сутки только у части животных оставались фрагменты лентовидных пучков SIS, а имплантат в основном замещался фиброзированной грануляционной тканью, в которой определялись участки с особым строением: короткие и тонкие коллагеновые волокна со слабой фуксинофилией по ван Гизону, а между ними пикринофильная фибриллярно-глобулярная субстанция (см. рис. 6, г). Это свидетельствует об активной биодеградации коллагена SIS вплоть до тончайших фибрилл. Только у отдельных животных оставались небольшие очаги вышеописанной глобулярно-фибриллярной субстанпип.

В 9-й группе через 7 сутки стенка бедренной артерии, обработанная ферментом террилитином, состояла из коллагенового каркаса, полностью лишенного клеток, с частичным эластолизом. Коллагеновые волокна местами подвергались разволокнению и истончению (рис. 7, а). Имплантаты вызывали слабую тканевую реакцию: только к 30-м суткам вокруг имплантатов формировалась капсула из незрелой грануляционной ткани. Внутрь бывшей tunica media фибробласты не прорастали, за исключением торцов имплантатов (см. рис. 7, б). Эти признаки отражают относительно медленную биодеградацию матрикса и задержку его замещения соединительной тканью реципиента. Через 60 сут клеточная резорбция и прорастание клетками имплантата значительно усиливались (см. рис. 7, в). Через 90 сут на месте имплантации оставались небольшие фрагменты имплантата, окруженные макрофагами и гигантскими клетками (см. рис. 7, г). Таким образом, тканевая реакция на сосудистый скаффолд была слабой, а его биодеградация замедленной.

 

Рис. 7. а, б, в, г.

Обсуждение

Коллагеновые матриксы, отвечая всем требованиям к скаффолдам для ТИК, имеют значительные преимущества перед скаффолдами из других компонентов межклеточного матрикса (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, эластин), а также других биоматериалов (хитозан, фиброин и др.), не говоря уже о скаффолдах из синтетических полимеров |8]. Во-первых, одно из важнейших достоинств коллагеновых матриксов заключается в том, что продукты разрушения коллагена, благодаря специфическому взаимодействию в организме коллагена с фибробластами по механизму обратной связи, стимулируют пролиферацию фибробластов и биосинтез собственного коллагена, т. е. регенерацию соединительной ткани [9]. Во-вторых, коллагеновые матриксы являются оптимальными скаффолдами для адгезии и роста клеток in vitro и in vivo, особенно при условии наличия достаточно развитой системы пор для питания клеток. В-третьих, биодеградацию коллагена можно регулировать, влияя на межмолекулярные сшивки. В-четвертых, коллаген легко образует комплексы с различными биологически активными веществами, положительно влияющими на регенерацию [10, 11].

В нашем исследовании коллагеновая губка (в том числе прессованная), реконструированная из раствора коллагена дермы коровы, - биосовместима и, обладая пористой структурой, быстро прорастает собственными клетками и сосудами. Однако первоначально она имеет сравнительно низкую механическую прочность, а после имплантации быстро (до 10 суток) резорбируется макрофагами, что делает ее неприемлемой для пластики трубчатых и полых органов (уретры, мочеточника, мочевого пузыря, сосудов, трахеи и т.д.), имеющих плотную стенку. В то же время эти материалы, по нашему опыту, перспективны для применения как скаффолды для ТИК и бесклеточные пластические материалы для замещения дефектов хряща и внутренних органов, тампонирования костных и других полостей, лечения кожных ран, трофических язв и ожогов [11]. Композит из уплотненной губки, полученной из реконструированного коллагена и викри- ловой сетки, обладает удовлетворительными свойствами для пластики трубчатых органов, так как совмещает хорошие механические свойства викрила и пористую структуру губки, ускоряющую прорастание клеток и сосудов для питания культивируемых эпителия, фибробластов и гладких мышц.

Децеллюляризированная дерма коров и лошадей в результате лиофилизации также приобретает пористую структуру, но более прочную, чем в губке из раствора коллагена, что подтверждается сохранностью фибрилл коллагена с периодической исчерченпостыо. Эти оригинальные матриксы имеют безусловную перспективу клинического и экспериментального применения, но нуждаются в дальнейшей модификации. Подслизистая основа кишки (S1S), уже сейчас используемая во многих исследованиях, имеет хорошие свойства, так как сравнительно быстро прорастает клетками и резорбируется. В настоящее время мы разработали материал на основе лиофилизированных матриц SIS, который показал улучшенные свойства по сравнению с исходным материалом. Ферментообработанные бесклеточные бедренные артерии, в которых остается только коллагеновый каркас, уже использовались нами в качестве ТИК для пластики уретры в эксперименте и клинике [12, 13].

Данные о технологии коллагеновых и гибридных матриксов, их структуре и ультраструктуре, механических свойствах, комплексообразовании с биологически активными веществами, особенностях культивирования на матриксах клеток, экспериментальных и клинических результатах пластики мочевых органов уже опубликованы [13,14] и будут представлены в дальнейших наших публикациях. 

 

Литература

1, Atala A. Regenerative medicine strategies. Journal of Pediatric Surgery. 2012;47( 1): 17-28. doi: 10.1016/j.jpedsurg.2011.10.013.

2. Liu Y, Bharadwaj S, Lee S, Atala A, Zhang Y. Optimization of a natural collagen scaffold to aid cell-matrix penetration for urologic tissue engineering. Biomaterials. 2009;30(23-24):3865-3873. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.04.008.

3. Akbal C, Lee S, Packer S, Davis M, Rink R, Kaefer M. Bladder augmentation with acellular dermal biomatrix in a diseased animal model. The Journal of Urology. 2006;176(4,Pt 2): 1706-1711. doi: 10.1016/j.juro.2006.04.085.

4.Colbert T, Sellaro T, Badylak S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683. doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.02.014.

5. Parenteau-Bareil R, Gauvin R, Berthod F. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications. Materials. 2010;3(3): 1863-1887. doi: 10.3390/ma3031863.

6. Fu W, Xu Y, Wang Z et al. New ureteral scaffold constructed with composite poly(L-lactic acid)-collagen and urothelial cells by new centrifugal seeding system. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 2012; 100A(7): 1725-1733. doi: 10.1002/jbm.a. 34134.

7. Ignatieva N, Guller A, Zakharkina Оet al. Laser-induced modification of the patellar ligament tissue: comparative study of structural and optical changes. Lasers in Medical Science. 2010;26(3):401-413. doi: 10.1007/sl0103-010-0871-0.

8. Badylak S. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 2007;28(25):3587-3593. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.04.043.

9. Shekhter A. Connective tissue as an integral system: role of cellcell and cell-matrix interactions. Connective Tissue Research. 1986;15(l-2):23-31.doi: 10.3109/03008208609001970.

10. Хилькин А.М., Шехтер А.Б., Истранов Л.П. Коллаген и его применение в медицине. М.: Медицина; 1976.

11. Истранова ЕВ., Абоянц Р.К., Истранов Л.П. Антимикробная активность коллагеновых губок. Фармация. 2011; 1:34-37.

12. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Николенко В.Н., Шехтер А.Б., ВинаровА.З., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Абоянн Р К., Люндуп А.В., Данилевский М.И., Гуллер А.Е., Елистратов П.А., БутнаруД.В., Кантимеров Д.Ф., Машин Г.А., Титов А.С., Проскура А.В., Кудричевская К.В. Заместительная уретропластика с использованием тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированной сосудистой матрицы и аутологичных клеток слизистой оболочки щеки: первый опыт. Урология. 2015;3:4-10.

13. Глыбочко П.В., Аляев Ю.Г., Николенко В.Н., Шехтер А.Б., ВинаровА.З., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Абоянц Р.К., Люндуп А.В., Данилевский М.И., Гуллер А.Е., Елистратов П.А., БутнаруД.В., Кантимеров Д.Ф., Машин Г.А., Титов А.С., Проскура А.В., Кудричевская К.В. Экспериментальное обоснование создания матрицы на основе децеллюляризированной сосудистой стенки с целью последующей заместительной уретропластики. Урология. 2014;6:41-46.

 

Источник: журнал «Архив патологии», № 6, 2015.